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Rotationsprojekt 5

Projektleiter:  

Dr. med. Marco Niesche
Assistenzarzt / Wissenschaftlicher Mitarbeiter
Klinik und Poliklinik für Neurochirurgie
Universitätsklinikum Carl Gustav Carus
der Technischen Universität Dresden
Fetscherstraße 74
01307 Dresden

Projekttitel:    3D-Neuroepitheliale Zysten als ein Hilfsmittel zur Beobachtung und Untersuchung von Regenerationsprozessen bei Verletzungen des Rückenmarks
Beteiligte SFB-Mitglieder:
(Co-Leiter)
 

Prof. Dr. Elly Tanaka
DFG-Forschungszentrum
für Regenerative Therapien Dresden (CRTD)
SFB-Teilprojekt A4

PD Dr. Matthias Kirsch
Klinik und Poliklinik für Neurochirurgie
Universitätsklinikum Carl Gustav Carus
der Technischen Universität Dresden

Prof. Dr. Gabriele Schackert
Klinik und Poliklinik für Neurochirurgie
Universitätsklinikum Carl Gustav Carus
der Technischen Universität Dresden

Förderzeitraum:   1. Oktober 2010 - 30. September 2011
Zusammenfassung:  

Gegenstand: Verletzungen des Rückenmarks bedeuten für Betroffene zumeist einschränkende Behinderungen mit schweren Begleiterkrankungen und geringen Möglichkeiten zur Regeneration. Von regenerierenden Amphibien weiß man, dass die Rekonstitution von Rückenmarksstrukturen ein höchst geordneter Prozess ist, welcher zelluläre Dedifferenzierung, Proliferation, Redifferenzierung und schließlich die Ausbildung einer ependymalen Tubenstruktur beinhaltet. In diesem Projekt sollen murine ES-Zellen ‘in vitro‘ kultiviert und in eine räumliche Formation neuroepithelialer Zystenstrukturen induziert werden. Um diese tubenähnliche Vorläuferstruktur zu generieren, ist es notwendig geeignete Konditionen und Techniken anzuwenden bzw. zu entwickeln.

Methoden: Murine ESC wurden in einer definierten Matrix kultiviert, basierend auf dem Model der Entwicklung von 3D neuroepithelialen Zysten ‘in vitro‘. Die Formation von Zysten erfolgt dabei zuverlässig innerhalb weniger Tage unter bestimmten Kulturbedingungen. Um diese Zysten entlang der rostrokaudalen Achse zu posteriorisieren und entlang der dorsoventralen Orientierung des RM zu entwickeln, wurden sie mit bestimmten posteriorisierenden, dorsalisierenden bzw. ventralisierenden Morphogenen zu bestimmten Zeitpunkten inkubiert. Die Zystenformation, Zellentwicklung und –differenzierung wurden qualitativ analysiert und quantifiziert anhand von Immunfluoreszenz, Konfokalmikroskopie, PCR und In-situ-Hybridisierung.

Resultate: Unter dem Gebrauch von definiertem Medium wuchsen die murinen ESC im Matrigel klonal unter der Formation von Zystenstrukturen. Mittels Behandlung mit RA wurden diese Zysten kaudalisiert auf ein cervikales Niveau der sich entwickelnden neuralen Achse. Diese kaudalisierten Zysten können entlang der dorsoventralen Achse des RM entwickelt werden. Nach Inkubation mit einem shh-Agonisten entwickelten sich ventrale Interneurone und Motoneurone. Unter der Behandlung mit dorsalisierenden Morphogenen wie BMP’s und Wnt’s entstanden dorsale sensorische Vorläuferzelltypen. Unter der Fusion dieser verschiedentlichen Zystentypen gelang die Entwicklung von polarisierten Zysten mit definierter dorsoventraler Polarität und einer klaren räumlichen Orientierung der Zellen im dreidimensionalen Zystenmodell.

Zusammenfassung: Bis zum aktuellen Zeitpunkt gelang die Etablierung eines 3D Zystenkulturmodells aus murinen ESC, welches eine räumliche und zeitliche neuroepitheliale Entwicklung des Neuralrohres ‘in vitro‘ nachahmt. Diese ependymalen, tubenähnlichen Aggregate exprimieren embryonale Antigene in definierten räumlichen Domänen und reagieren auf lokotypische Morphogene mit neuronaler Spezifizierung und der Formation von neuralem Gewebe. Diese transplantierbaren Aggregate sollen die regenerative Fähigkeit von verletztem Gewebe des ZNS anregen, axonales Wachstum verstärken und eine Rekonstitution des verletzten RM ermöglichen. Um Verhalten und Integration dieser neuroepithelialen Zysten ‘in vivo‘ zu untersuchen, planen wir die Implantation dieser Zysten in einem Modell eines verletzten Rückenmarks der Ratte. Untersucht werden sollen Tumorigenität, axonales Wachstum in verschiedenen Matrizen, zelluläre und histologische Integration, funktionelle Verbesserung und maximales Ausmaß einer zu überbrückenden Läsion.

Relevante Publikationen:  
  1. Cao QL, Zhang YP, Howard RM, Walters WM, Tsoulfas P, Whittemore SR: Pluripotentstem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage. ExpNeurol 167:48-58, 2001
  2. Chow SY, Moul J, Tobias CA, et al.: Characterization and intraspinal grafting of EGF/bFGF-dependent neurospheres derived from embryonic rat spinal cord. Brain Res 874:87-106, 2000
  3. Vogel S: [Regeneration after spinal cord dissection in Ambystoma mexicanum]. Z Exp Chir 6:219-224, 1973
  4. Schnapp E, Kragl M, Rubin L, Tanaka EM: Hedgehog signaling controls dorsoventral patterning, blastema cell proliferation and cartilage induction during axolotl tail regeneration. Development 132:3243-3253, 2005

 

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